Cẩm nang chuẩn đoán bệnh cây - P8: Lây bệnh nhân tạo

P1 | P2 | P3 | P4 | P5 | P6 | P7 | P8 | P9 | P10 | P11 | P12 | P13 | P14

Để thực hiện quá trình lây bệnh nhân tạo, các loài cây mẫn cảm được trồng trong các điều kiện có kiểm soát và được cấy vi sinh vật nghi là gây bệnh. Việc lây bệnh nhân tạo có thể cung cấp thông tin để:

• Khẳng định một sinh vật được phân lập là tác nhân gây bệnh theo quy tắc Koch (Khung dưới)

• Xác định phổ ký chủ của tác nhân gây bệnh
• Đo độc tính các mẫu cấy khác nhau của tác nhân gây bệnh.

Khi chọn lựa những cây khỏe mạnh để lây bệnh nhân tạo theo quy tắc Koch, nên lưu ý dùng cùng một giống với cây bị bệnh mà từ đó tác nhân gây bệnh được phân lập. Như vậy các triệu chứng biểu hiện khi lây bệnh nhân tạo sẽ rất gần với các triệu chứng bệnh ban đầu ngoài tự nhiên - các giống cây trồng có thể có độ mẫn cảm khác nhau đáng kể đối với một tác nhân gây bệnh.

Các bước thực hiện quy tắc Koch

Các yếu tố cần được cân nhắc trong quá trình lây bệnh nhân tạo bao gồm:

• Nhiệt độ
• Quá ít hoặc quá nhiều nước
• Độ độc hoặc thiếu hụt chất dinh dưỡng
• Lượng nguồn bệnh trộn vào đất không thực tiễn (quá ít hoặc quá nhiều)
• Các điều kiện trồng nói chung.

Nếu tất cả các thí nghiệm và các công thức lây bệnh đều được bố trí các công thức đối chứng (không lây bệnh) để so sánh với các công thức được lây bệnh, ảnh hưởng của những yếu tố này có thể được đo và giải thích. Công thức đối chứng cũng là một phương tiện để so sánh và có thể làm nổi bật các thiếu sót trong thí nghiệm nếu có.

Luôn luôn bố trí công thức đối chứng (bao gồm các cây không được lây bệnh) trong các thí nghiệm lây bệnh nhân tạo

1. Các phương pháp lây bệnh nhân tạo

Một phần quan trọng của việc chẩn đoán bệnh là việc tái tạo bệnh trong quá trình lây bệnh nhân tạo nhằm hoàn tất các quy tắc Koch. Bệnh có thể được tái tạo bằng cách cấy tác nhân gây bệnh lên bề mặt cây trồng theo cơ chế xâm nhiễm của tác nhân đó, hoặc bằng cách đưa mầm bệnh trực tiếp vào cây. Chọn phương pháp nào là tùy thuộc vào tác nhân gây bệnh được thí nghiệm (Bảng 8.1).

Bảng các phương pháp lây bệnh nhân tạo

Độ ẩm cao tạo điều kiện cho việc xâm nhiễm và lan truyền của nhiều bệnh. Phun sương hoặc để ẩm (bằng túi ny lông che phủ chậu trồng cây) có thể tạo một môi trường ẩm và làm tăng đáng tỷ lệ thành công của thí nghiệm lây bệnh nhân tạo. Không nên đặt các chậu trong tủ ẩm hoặc có ny lông che phủ trực tiếp dưới ánh nắng.

1.1. Lây bệnh lên lá và thân

Lây bệnh lên lá và thân là một thí nghiệm đơn giản không đòi hỏi nhân sinh khối nguồn bệnh trong bình tam giác (Hình 8.1). Các triệu chứng được tái tạo nhanh chóng, nhưng mô cây được tạo vết thương bằng một dụng cụ nhọn, không mô phỏng được quá trình xâm nhiễm ngoài tự nhiên.

Nên trồng hai cây trong một chậu - một được lây bệnh và cây kia dùng làm đối chứng để so sánh. Phương pháp này cũng có thể áp dụng thành công để lây bệnh lên các bộ phận khác của cây, như hoa và quả.

Lây bệnh lên thân cây

1. Dùng que cấy hoặc kim tiêm chọc vào phần thân dưới của cây được lây bệnh và gắn một miếng thạch nhỏ từ mẫu tác nhân gây bệnh đã làm thuần vào vị trí vết thương (hoặc tiêm một lượng nhỏ dịch bào tử vào thân, dùng kim và ống tiêm).

2. Dùng que cấy hoặc kim tiêm chọc vào phần thân dưới của cây đối chứng nhưng không lây bệnh.

3. Dùng parafilm hoặc màng ny lon bọc vết thương hoặc vị trí lây bệnh.

4. Tưới ẩm cho đất mỗi ngày.

5. Kiểm tra và so sánh những cây được lây bệnh với những cây đối chứng. Quan sát và ghi nhận các triệu chứng và so sánh những triệu chứng này với các triệu chứng đã quan sát trên đồng ruộng.

Lây bệnh lên lá

1. Phun dịch bào tử lên lá cây được lây bệnh (hoặc nhỏ vài giọt dịch bào tử lên một số lá).

2. Phun nước vô trùng lên lá cây dùng làm đối chứng (hoặc nhỏ vài giọt nước vô trùng lên một số lá).

3. Đặt chậu trong tủ ẩm hoặc che bằng túi ny lông trong nhà lưới, tránh ánh nắng trực tiếp.

4. Kiểm tra và so sánh những cây được lây bệnh với những cây đối chứng. Quan sát và ghi nhận các triệu chứng và so sánh những triệu chứng này với các triệu chứng đã quan sát được trên đồng ruộng.

Lây bệnh nhân tạo bằng phương pháp lây bệnh lên thân: (a) gây vết thương vào thân dưới của cây, (b) cấy nguồn bệnh vào vị trí vết thương, (c) bọc vị trí vết thương bằng ny lông, (d) sợi nấm phát triển trên mặt đất từ thân bị bệnh, (e) cây được lây bệnh (trái) và cây đối chứng (phải)

1.2. Lây bệnh vào đất

Có thể lây bệnh trực tiếp vào đất bằng dung dịch bào tử lấy từ môi trường thuần hoặc từ sinh khối vi sinh vật gây bệnh được nhân trong bình tam giác (Hình 8.2). Dịch bào tử nấm hoặc dịch khuẩn có thể được tưới vào đất sau khi nảy mầm sao cho chúng được tiếp xúc trực tiếp với hệ thống rễ. Phương pháp này được thực hiện để lây bệnh nhanh ban đầu.

Một quá trình lây nhiễm tự nhiên hơn được thực hiện bằng phương pháp hỗn hợp hoặc phương pháp lớp mỏng. Cả hai phương pháp này đều yêu cầu nhân sinh khối nguồn bệnh trên một giá thể tự nhiên, như hạt kê hoặc vỏ trấu. Việc nhân sinh khối mẫu cấy trên các giá thể này trong bình tam giác cần thời gian khoảng 2-3 tuần. Một lượng sinh khối nguồn bệnh tiêu chuẩn được dùng cho cả hai phương pháp. Tuy nhiên do tác nhân gây bệnh được đưa vào đất cùng thời điểm trồng cây nên cây có thể nhiễm bệnh khi còn ở giai đoạn cây con - việc này có thể gây ra các kết quả sai lệch nếu mục đích của lây bệnh nhân tạo là để tái tạo bệnh trên cây trưởng thành.

Các phương pháp lây bệnh nhân tạo bằng cách đưa vi sinh vật vào đất

2. Chuẩn bị nguồn bệnh cho quá trình lây bệnh nhân tạo

2.1. Dịch bào tử

Chuẩn bị nguồn nấm bệnh cho việc tạo dịch bào tử bằng cách nuôi nấm trên môi trường thạch nước cất chứa hạt, mẩu thân hoặc lá đã khử trùng, trên môi trường thạch lá cẩm chướng, hoặc trên môi trường thạch đường khoai tây nửa độ mạnh. Một cách đơn giản là cạo các bào tử và sợi nấm ra khỏi đĩa cấy và cho vào nước vô trùng. Dịch bào tử này có thể được đổ lên trên đất.

2.2. Môi trường hạt kê/vỏ trấu (thể tích 50:50)

1. Ngâm hạt kê và vỏ trấu trong nước và để qua đêm trong tủ lạnh, để hỗn hợp ngấm nước.

2. Chắt bỏ phần nước.

3. Cho khoảng 150mL giá thể vào một bình tam giác dung tích 250 mL (Hình 8.3-8.5).

4. Cuộn thật chặt một nút bông gòn, bọc ngoài bằng vải màn để nút chặt miệng bình tam giác.

5. Dùng giấy nhôm phủ lên miệng bình và hấp khử trùng. (Mục đích là giữ cho phần miệng bình được tiệt trùng trước khi cấy nguồn bệnh và nút bông gòn vẫn khô trong khi hấp.)

6. Để bình nguội.

7. Cấy các miếng thạch có sợi nấm hoặc dịch bào tử vào giá thể trong bình tam giác, chú ý để nút bình vẫn trong điều kiện vô trùng, thao tác này được thực hiện trong tủ cấy vô trùng.

8. Đặt các bình tam giác ở nhiệt độ khoảng 25oC trong 2 tuần trong điều kiện sáng và tối xen kẽ để hoàn thành quá trình nhân sinh khối nấm trên giá thể.

9. Lắc bình tam giác 2-3 ngày sau khi cấy để đảm bảo nguồn bệnh được phân bố đều trong giá thể.

Một bình tam giác chứa nguồn bệnh 

Dùng các mẫu cấy 'còn mới' (mới phân lập) để chuẩn bị nguồn bệnh. Các mẫu đã được cấy truyền nhiều lần trên môi trường giàu dinh dưỡng thường bị giảm độc tính.

Chuẩn bị giá thể hạt kê/vỏ trấu trong bình tam giác

Chuẩn bị giá thể hạt kê/vỏ trấu cho quá trình lây bệnh nhân tạo: (a) hạt kê và vỏ trấu đã được ngâm trong nước cất 24 giờ, (b) trộn đều các thành phần của giá thể, (c và d) đưa giá thể vào bình tam giác dùng một phễu tự chế, (e) bình tam giác được nút kín bằng bông gòn gói trong vải màn, (f ) cổ bình được phủ bằng giấy nhôm sẵn sàng cho vào nồi hấp.

Cuốn cẩm nang này được sắp xếp thành các phần sau:

• Phần 1: Phần giới thiệu
• Phần 2: Tổng quát về sức khỏe thực vật và các yếu tố ảnh hưởng
• Phần 3: Quy trình chẩn đoán tác nhân gây bệnh trong phòng thí nghiệm và ngoài đồng ruộng
• Phần 4: Các triệu chứng bệnh cây
• Phần 5: Quy trình và thiết bị làm việc trên đồng ruộng
• Phần 6: Quy trình và thiết bị làm việc trong phòng thí nghiệm
• Phần 7: Giới thiệu sơ lược về phân loại nấm
• Phần 8: Các phương pháp lây bệnh nhân tạo
• Phần 9: Quản lý bệnh hại tổng hợp
• Phần 10: Các bệnh do nấm có nguồn gốc từ đất
• Phần 11: Các bệnh thường gặp trên một số cây trồng có ý nghĩa kinh tế
• Phần 12: Ảnh hưởng sức khỏe từ nấm gây bệnh
• Phần 13: Thiết kế, xây dựng và vận hành các phòng thí nghiệm và nhà lưới dùng cho chẩn đoán
• Phần 14: Phụ lục về cách làm que cấy dẹp, sức khỏe an toàn trong công việc, cũng như các công thức nấu môi trường, các phương pháp khử trùng, và các phương pháp lưu giữ mẫu nấm.