Cẩm nang bệnh cây - P13: Phòng thí nghiệm chẩn đoán và nhà lưới

P1 | P2 | P3 | P4 | P5 | P6 | P7 | P8 | P9 | P10 | P11 | P12 | P13 | P14

1. Phòng thí nghiệm chẩn đoán

Những gợi ý sau dựa trên những phòng thí nghiệm chẩn đoán được xây dựng tại Chi cục Bảo vệ thực vật Quảng Nam, Thừa Thiên Huế, Nghệ An và Trường Đại học Nông lâm Huế thông qua tài trợ của dự án ACIAR “Chẩn đoán, khuyến nông và phòng trừ bệnh hại cây trồng tại các tỉnh miền Trung Việt Nam, CP/2002/115”. Những phòng thí nghiệm này được xây dựng với mục đích chủ yếu là hỗ trợ công tác chẩn đoán bệnh do nấm. Tuy nhiên, các phương tiện trong phòng thí nghiệm cũng thích hợp cho việc phân lập các vi khuẩn gây bệnh cây phổ biến. Khi làm việc tại bất cứ một phòng thí nghiệm nào, các vấn đề an toàn và rủi ro ảnh hưởng đến sức khỏe đều phải được chú ý. Phụ lục 2, sức khỏe và an toàn, phác họa các rủi ro thường gặp phải trong một phòng thí nghiệm nghiên cứu chẩn đoán bệnh cây. Tuy nhiên, cần tham khảo ý kiến phụ trách phòng thí nghiệm trước khi vào một phòng thí nghiệm không quen thuộc.

1.1. Vị trí phòng thí nghiệm

Một phòng thí nghiệm chẩn đoán cần được bố trí trong một tòa nhà với tường bảo vệ tránh mưa. Tại những vùng nhiệt đới, nấm thường mọc ở mặt bên trong phía tường có mưa hắt. Nấm mọc như vậy có thể tạo các bào tử làm lẫn tạp môi trường nuôi cấy. Phòng thí nghiệm nên ở trên tầng hai là lý tưởng nhất. Điều này giảm các vấn đề về chuột và các sâu bọ khác như kiến. Phòng thí nghiệm nên có hai phòng lớn, một phòng để chuẩn bị và một phòng sạch.

Nên có một phòng hoặc một khu vực có mái che dùng để kiểm tra sơ bộ các mẫu từ đồng ruộng và rửa sạch đất khỏi mẫu rễ. Tại nơi này, các mẫu cây nhỏ được chọn lọc cho việc phân lập tác nhân nấm hoặc vi khuẩn trong phòng sạch. Nơi này cũng có thể được dùng để tách lấy tuyến trùng ký sinh thực vật từ đất.

Hình 1 Sắp xếp thiết bị trong một phòng thí nghiệm chẩn đoán (phòng thí nghiệm tại Chi cục BVTV Nghệ An): (a) và (b) hai vị trí trong phòng sạch, (c) và (d) hai vị trí trong phòng chuẩn bị.

1.2. Phòng chuẩn bị

Phòng chuẩn bị được dùng để chuẩn bị môi trường, bao gồm khử trùng dụng cụ và vật liệu trong nồi hấp, khử trùng đĩa Petri trong tủ sấy, rửa và cất giữ đồ thủy tinh, hóa chất và các vật dụng cơ bản khác. Phòng này cần có một quạt hút hơi để hút hơi nóng từ nồi hấp và tủ sấy.

1.3 Phòng sạch

Phòng sạch dùng để phân lập nấm và vi khuẩn từ các mẫu cây bệnh đã được làm sạch. Phòng cũng được dùng để nuôi cấy các mẫu vi sinh vật trong điều kiện sạch. Các kính hiển vi được đặt trong phòng này nhằm kiểm tra các mẫu nuôi cấy và các cấu trúc nấm.

 Không kiểm tra các cây lớn trong phòng sạch. Phân lập từ các mẫu cây nhỏ đã được rửa sạch bụi và đất bên ngoài trước khi đưa vào phòng thí nghiệm.

Nếu điều kiện cho phép, phòng này cần được trang bị máy điều hòa không khí để bảo vệ thiết bị và các mẫu nuôi cấy. Phòng cũng cần được giữ cho khỏi bụi và côn trùng. Tuy nhiên, đừng để phòng quá kín hơi, nếu không độ ẩm sẽ quá cao và nấm mốc sẽ phát triển trên tường cũng như trên thiết bị. Nên dùng một máy hút ẩm trong phòng này. Không được mang đất vào phòng sạch bởi vì đất là nguồn của nhện ăn nấm có thể làm lẫn tạp các mẫu nuôi cấy.

2. Bố trí phòng thí nghiệm

Khi thiết kế một phòng thí nghiệm, có nhiều khía cạnh cần xem xét. Điều quan trọng là công việc được tiến hành theo một thứ tự hợp lý và những bước chính của quá trình chẩn đoán nên được tách riêng khỏi nhau. Sau đây là sơ đồ bố trí của một phòng thí nghiệm chẩn đoán (Hình 2), chủ yếu là để chẩn đoán các tác nhân nấm gây bệnh thực vật.

Hình 2 Sơ đồ phòng thí nghiệm chẩn đoán, biểu thị sơ đồ bố trí thiết bị và bàn.

3. Thiết bị phòng thí nghiệm

3.1. Thiết bị cho phòng sạch

Những thiết bị cần thiết cho phòng này được liệt kê bên dưới và minh họa trong Hình 2

• Một kính hiển vi có gắn vật kính ×10, ×20, ×40, và ×100 (vật kính dầu). Một kính hiển vi cơ bản loại thường là đủ cho hầu hết các công việc chẩn đoán. Nếu có điều kiện tài chính, kính hiển vi có thể gắn với một vật kính luyện kim ×20 với khoảng cách làm việc xa. Vật kính này lý tưởng cho việc kiểm tra in situ các cấu trúc nấm trên môi trường nhân tạo, bởi vì khoảng cách từ vật kính tới mẫu quan sát khá xa (xem Phần 6 mục 2.2).
• Một kính lúp soi nổi để kiểm tra các mẫu cây bệnh tìm cấu trúc nấm. Điều này đặc biệt quan trọng đối với nhiều tác nhân gây bệnh trên lá mà không thể nuôi cấy được trên môi trường nhân tạo. Kính cũng được dùng để cấy đơn bào tử nảy mầm hoặc cấy đỉnh sinh trưởng sợi nấm để làm thuần mẫu nuôi cấy, và để nghiên cứu tuyến trùng gây bệnh cây (xem Phần 6.2.1).
• Một tủ cấy vô trùng dùng để đổ môi trường và phân lập nấm khỏi mô cây. Trong điều kiện khí hậu nhiệt đới ở Việt Nam, có nhiều bào tử nấm trong không khí. Những bào tử này lẫn tạp môi trường khi đổ, cấy phân lập hoặc cấy truyền mẫu nuôi cấy, trừ khi các thao tác được tiến hành trong một tủ cấy vô trùng.
• Một giá dài có gắn đèn huỳnh quang bên trên để kích thích việc sản sinh bào tử và sắc tố ở nhiều loài nấm trên môi trường nhân tạo hoặc trên mẫu lá để ẩm. Nên có một giá cho các mẫu nuôi cấy sạch và một giá riêng cho các mẫu phân lập. Một tủ mẫu nuôi cấy sẽ thuận tiện cho việc nuôi các đĩa cấy cần điều kiện bóng tối. Việc này cần thiết đối với các mẫu nuôi cấy trên môi trường có chất kháng sinh bị phân hủy dưới tác động của ánh sáng (ví dụ như môi trường chọn lọc cho Phytophthora).
• Một tủ lạnh để dự trữ các môi trường trong chai lọ, đĩa Perti chứa môi trường (trong bịch ny lông hoặc giấy nhôm để tránh cho môi trường khỏi bị khô), cũng như chất kháng sinh, mẫu nuôi cấy và các mẫu bệnh nhỏ.

• Cần có một cân điện tử với độ chính xác 0,001 g để cân lượng kháng sinh hoặc hoá chất nhỏ.
• Các bàn làm việc lớn, một để kính hiển vi và cân điện tử, một cho công việc phân lập chung và nuôi cấy.
• Ghế ngồi thoải mái ở các bàn làm việc.
• Sổ ghi chép mẫu, để ghi chi tiết mỗi lần chẩn đoán cũng như danh sách các mẫu vi sinh vật lưu trữ.
• Một giá sách gồm một loạt các ấn bản thông tin về bệnh:

- Sách giáo khoa

- Cẩm nang

- Trích lược bệnh

- Các bài báo khoa học

• Ít nhất một máy vi tính nối mạng internet và một máy in cho:

- Công việc lưu trữ cơ sở dữ liệu

- Tìm kiếm thông tin

- Tiếp cận các thư viện hình ảnh

- Liên lạc qua thư điện tử.

• Các dụng cụ nhỏ cho công việc phân lập và cấy, bao gồm:

- Kẹp nhỏ

- Que cấy

- Cán dao mổ

- Que cấy khuẩn

- Lưỡi dao mổ

- Bút đánh dấu

- Dao nhỏ

- Cồn êtyl

- Que cấy truyền nấm (đầu dẹp)

- Giấy lau

- Thớt

- Lam kính và lamen

- Giấy lọc.

Kiểm tra tường và thiết bị thường xuyên để xem có bị nấm mọc hay không.

Sàn phòng sạch cần được lau chùi thường xuyên để loại bỏ bụi bẩn. Cần phải tắt quạt và đóng cửa sổ trong khi nuôi cấy để làm giảm sự di chuyển của không khí trong phòng. Công việc quan trọng cần được thực hiện trong buồng cấy đã được lau sạch bằng cồn 70%.

Khử trùng bề mặt khi cần.

Hình 3 Dụng cụ cần thiết cho việc phân lập, cấy truyền, làm thuần và giám định các tác nhân nấm và vi khuẩn gây bệnh

Khử trùng mặt bàn và rửa tay trước khi làm việc với bất cứ mẫu cấy sạch nào để giảm nguy cơ lẫn tạp.

3.2. Thiết bị cho phòng chuẩn bị

Những thiết bị cần thiết cho phòng chuẩn bị được liệt kê bên dưới và minh họa trong Hình 1:

• Một tủ sấy để khử trùng đĩa Petri, đĩa Petri cần được gói trong giấy báo hoặc túi giấy.
• Một nồi hấp nhỏ thích hợp cho khử trùng 1-2 lít môi trường hoặc nước trong bình tam giác hoặc chai Schott. Nồi hấp cũng có thể được dùng để khử trùng môi trường hoặc nước trong ống nghiệm thủy tinh hoặc chai McCartney, pipet và các đồ thủy tinh khác gói trong giấy hoặc giấy nhôm.
• Một nồi áp suất để khử trùng lượng nhỏ môi trường và nước. Có thể mua thiết bị này ở hầu hết các chợ lớn.
• Một cân (độ chính xác đến 0,1 g) để cân hóa chất, khoai tây, cà rốt và những nguyên vật liệu tương tự cho việc chuẩn bị môi trường.
• Một bếp điện để nấu khoai tây và cà rốt dùng cho môi trường.
• Một bàn để chuẩn bị môi trường.
• Một bồn để rửa đĩa Petri và các đồ thủy tinh khác.
• Một tủ đựng.

4. Nhà lưới cho việc nghiên cứu bệnh cây

Nhà lưới là một phần quan trọng của phòng thí nghiệm chẩn đoán bởi vì nhà lưới cần cho việc thực hiện quá trình lây bệnh nhân tạo, đánh giá thuốc trừ nấm và các phương pháp phòng trừ bệnh khác. Việc thiết kế cần đảm bảo điều kiện giúp cho cây mọc tốt và ngăn ngừa lẫn tạp giữa các thí nghiệm lây bệnh nhân tạo và các thí nghiệm khác (Hình 4).

Một nhà lưới cơ bản cần có:

• Mái che trong suốt
• Sàn xi măng dốc thoát nước tốt
• Thoáng khí tốt trong điều kiện trời nóng (quạt cầu thông gió rất hiệu quả) (Hình 5)
• Thiết kế chống chuột
• Nguồn cung cấp nước tốt
• Các bàn dài (Hình 5)
• Một khu vực chuẩn bị bên trong hoặc gần nhà lưới.

Mái trong suốt cho phép ít nhất 75% ánh nắng xuyên qua. Dùng vật liệu polycarbonate làm mái rất tốt vì chống được tia tử ngoại, rất bền và dễ gắn vào khung mái sắt hay gỗ.

Tấm nhựa cũng có thể dùng làm mái nhưng chỉ bền độ 1-2 năm. Mái thủy tinh không thích hợp cho những vùng có bão tố hoặc mưa đá. Tốt nhất là mái được gắn sao cho hiên được kín (tránh bão tố). Lưới che nắng có thể được dùng trong mùa hè để giảm nhiệt độ trong nhà lưới (Hình 5).

Một sàn xi măng dốc thoát nước tốt và có thể được giữ sạch bằng vòi xịt nước.

Hình 4 Sơ đồ minh họa thiết kế một nhà lưới thích hợp cho việc lây bệnh nhân tạo và các công việc thí nghiệm với tác nhân gây bệnh thực vật.

Hình 5 Nhà lưới dùng cho nghiên cứu bệnh cây tại Chi cục BVTV Quảng Nam: (a) hình ảnh tổng quát của nhà lưới với lưới chống côn trùng, (b) lưới che nắng và mái tôn nhựa polycarbonate phẳng với các bộ quạt cầu thông gió

Bốn bên nhà lưới có thể là tường gạch (cao khoảng 1m). Lưới sắt (như lưới B40) hoặc lưới sắt mạ kẽm (lỗ khoảng 1 cm đường kính) có thể gắn giữa các cột, tường gạch thấp và kèo cột đỡ mái. Lưới sắt giúp thông hơi tốt đồng thời ngăn chuột và chim chóc vào nhà lưới. Lưới chống côn trùng tuy tốn kém, nhưng quan trọng vì có thể ngăn côn trùng xâm nhập vào nhà lưới.

Cần một nguồn nước tốt để giữ cho sàn sạch và để cung cấp nước sạch bệnh cho cây. Ống dẫn nước phải được mắc trên tường sao cho đầu vòi tưới không bao giờ chạm sàn.

Có điện thắp sáng và vận hành thiết bị thì rất tiện lợi.

Các bàn thép chống gỉ để đặt các chậu cây nên cao khoảng 1 m và dài khoảng 2-3 m. Độ cao này giảm tối thiểu khả năng bị lẫn tạp từ sàn. Nên có bàn dài loại dễ di chuyển, để có thể di dời dễ dàng khi cần cho các cây cao, cây có thân leo lên giàn hoặc cây ăn quả còn nhỏ trồng trong chậu lớn. Có thể dùng bàn làm bằng tre nhưng phải được xử lý với thuốc trừ nấm để ngăn mốc.

Một cân đĩa 10 kg nên để trong nhà lưới để cân các chậu trồng cây nhằm theo dõi lượng nước trong giá thể trồng.

4.1. Khu chuẩn bị

Khu chuẩn bị có thể ở trong nhà lưới hoặc trong khu nhà gần đó. Nên có các giá đựng đồ cao khỏi mặt sàn để chứa các chậu và dụng cụ. Cũng nên có nơi chứa hỗn hợp giá thể hoặc cát, xơ dừa, mùn cưa đã mục hoặc các nguyên liệu sạch bệnh khác để trồng cây phục vụ thí nghiệm lây bệnh nhân tạo. Một bàn cần dùng cho việc chuẩn bị các chậu cây, lây bệnh vào đất và các công việc khác. Mặt bàn cần làm bằng vật liệu dễ khử trùng, như thép không gỉ hoặc đá hoa.

4.2. Hỗn hợp giá thể

Giá thể sạch bệnh rất cần thiết cho quá trình lây bệnh nhân tạo và nhiều thí nghiệm khác. Giá thể sạch bệnh cũng cần cho việc sản xuất cây con và giâm hom sạch bệnh trước khi đưa ra trồng ở ruộng thí nghiệm.

Có nhiều loại giá thể. Các đặc tính chính của hỗn hợp giá thể tốt là khả năng giữ nước tốt và dễ thoát nước. Có vài loại hỗn hợp giá thể được sử dụng ở Việt Nam. Vật liệu phổ biến bao gồm mùn cưa mục, xơ dừa, cát, than bùn và phân gà viên.

Một số thành phần này có thể chứa tác nhân gây bệnh; cát có thể chứa các tác nhân gây bệnh như Pythium và Phytophthora. Xơ dừa và mùn cưa thường sạch bệnh.

Đất ruộng thường mang nhiều tác nhân gây bệnh thực vật. Những tác nhân này cần được diệt trừ bằng xông hơi hoặc xử lý nhiệt (khử trùng bằng hỗn hợp hơi nước/không khí ở 60oC trong 30 phút) trước khi đất có thể được dùng cho quá trình lây bệnh nhân tạo. Đất từ đồng ruộng chưa được xử lý không được mang vào nhà lưới bởi vì các tác nhân trong đất có thể làm lẫn tạp nhà lưới.

Hỗn hợp giá thể mùn cưa có thể được làm với mùn cưa, cát và phân gà viên (70:28:2 theo thể tích) và ủ trong 4-6 tháng. Đầu tiên, giá thể trộn này phải nóng tới khoảng 50oC trong thời gian dài để loại trừ bất cứ tác nhân gây bệnh nào tồn tại trong đó. Hỗn hợp giá thể cần được ủ mục trong các thùng lớn. Điều quan trọng là tránh để giá thể tiếp xúc trực tiếp với đất ruộng hoặc cây bệnh. Xơ dừa có thể là một thành phần lý tưởng cho giá thể. Hỗn hợp giá thể cũng có thể được tiệt trùng bằng hỗn hợp hơi nước/không khí nếu chưa được ủ mục.

Có thể trộn hỗn hợp giá thể trong máy trộn xi măng sạch. Hạt phân bón có thể được thêm vào trong khi trộn.

4.3. Vệ sinh nhà lưới

Cần có các quy định chặt chẽ đối với cán bộ sử dụng nhà lưới để tránh làm nhiễm tạp các thí nghiệm lây bệnh nhân tạo hoặc các nghiên cứu khác với tác nhân gây bệnh trong đất ruộng. Thiết bị và quy trình cần tuân thủ bao gồm:

• Đặt một bồn rửa chân nơi cửa ra vào
• Có dép hoặc ủng cao su chỉ để dùng trong nhà lưới
• Không mang đất từ đồng ruộng hoặc cây bệnh vào nhà lưới
• Loại bỏ cây và đất dùng trong thí nghiệm ngay sau khi thí nghiệm hoàn tất và đốt hủy các cây bệnh
• Dùng nước sạch bệnh
• Luôn giữ cho đầu vòi nước không chạm sàn nhà
• Phun xịt rửa sàn đều đặn
• Cán bộ không được vào nhà lưới ngay sau khi thăm ruộng mà phải tắm rửa và thay quần áo sạch trước khi sử dụng nhà lưới
• Khử trùng tất cả các chậu với thuốc khử trùng mạnh sau khi dùng trong thí nghiệm, như dung dịch nước Javen 1% trong 24 giờ
• Để các chậu đã khử trùng trên giá cao cách xa mặt sàn
• Xử lý bàn tre với thuốc trừ nấm chứa đồng.

4.4. Quản lý và dinh dưỡng cây trồng

Trồng cây trong chậu cho quá trình lây bệnh nhân tạo và các nghiên cứu khác đòi hỏi việc quản lý cẩn thận vấn đề dinh dưỡng cây.

Các chậu nên có lỗ dưới đáy để thoát nước tốt. Sỏi nhỏ có thể được để dưới đáy chậu để giúp cho việc thoát nước tốt. Mục đích là để tránh nước đọng trong đất nơi rễ phát triển. Cân chậu thường xuyên để duy trì độ ẩm ổn định trong hỗn hợp giá thể và tránh nước đọng. Chỉ nên tưới nước cho giá thể đến ngưỡng “năng lực đồng ruộng”.

Cây cần được trồng trong hỗn hợp giá thể sạch bệnh. Việc chọn lựa loại hỗn hợp giá thể tùy thuộc loại cây trồng, nguyên liệu sẵn có và tính chất của thí nghiệm. Cần cung cấp đủ dinh dưỡng cho sự tăng trưởng bình thường của cây. Có thể cần bổ sung thêm phân bón dạng hạt vào giá thể trước khi trồng. Thường thì phân bón lỏng như dung dịch Hoagland's hoặc một sản phẩm thương mại được dùng 1-2 tuần một lần để duy trì sự tăng trưởng bình thường của cây (Hình 6). Cần bón thêm phân lỏng đều đặn đặc biệt nếu cây lớn được trồng trong chậu nhỏ trong thời gian dài. Phân N-P-K dạng lỏng đậm đặc và các phân vi lượng dạng lỏng đậm đặc có sẵn ở Việt Nam.

Hình 6 Chuẩn bị phân bón thương phẩm để dùng trong nhà lưới

Có thể dùng dung dịch Hoagland’s thay thế (xem công thức trong Khung 1). Việc này đặc biệt có lợi nếu tình trạng dinh dưỡng cần được giám sát, hoặc các chất dinh dưỡng nào đó được cần được loại bỏ trong thí nghiệm nghiên cứu về dinh dưỡng.

Dung dịch dinh dưỡng cây trồng Hoagland's

Dung dịch này có tất cả các chất dinh dưỡng cần thiết cho cây phát triển và tăng trưởng. Dung dịch Hoagland's được pha từ một số dung dịch mẹ pha sẵn, trộn với nước trước khi dùng.

Thêm vào mỗi lít nước:

+ 5 mL - dung dịch nitrat kali -

+ 5 mL - dung dịch nitrat canxi -

+ 1 mL - dung dịch photphat axit kali -

+ 2 mL - dung dịch sunphat magie -

+ 1 mL - dung dịch vi lượng mẹ pha sẵn -

+ 10 mL - dung dịch sắt - EDDHA pha sẵn -

Dung dịch mẹ:

+ 1 M - KNO3 - nitrate kali - (khoảng 101 g trong 1 L)

+ 1 M - Ca(NO3)2.4H2O - nitrate canxi - (khoảng 236 g trong 1 L)

+ 1 M - KH2PO4 - Photphat axit kali - (khoảng 136 g trong 1 L)

+ 1 M - MgSO4.7H2O - sunphate magie - (khoảng 246.5 g trong 1 L).

Dinh dưỡng vi lượng làm sẵn:

+ 0.046 M - H3BO3 - Axit boric - (khoảng 2.86 g trong 1 L)

+ 0.009 M - MnCl2.4H20 - clorua mangan - (khoảng 1.81 g trong 1 L)

+ 0.765mM - ZnSO4.7H2O - sunphat kẽm - (khoảng 0.22 g trong 1 L)

+ 0.320mM - CuSO4.5H2O - sunphat đồng - (khoảng 0.08 g trong 1 L)

+ 0.111mM - H2MoO4.H2O - molybdic acid (85%) - (khoảng 0.02 g trong 1 L)

Dung dịch sắt - EDDHA pha sẵn

+ 10mM - Fe(NO3)3 - sắt - EDDHA - (khoảng 2.45 g trong 1 L)

Cuốn cẩm nang này được sắp xếp thành các phần sau:

• Phần 1: Phần giới thiệu
• Phần 2: Tổng quát về sức khỏe thực vật và các yếu tố ảnh hưởng
• Phần 3: Quy trình chẩn đoán tác nhân gây bệnh trong phòng thí nghiệm và ngoài đồng ruộng
• Phần 4: Các triệu chứng bệnh cây
• Phần 5: Quy trình và thiết bị làm việc trên đồng ruộng
• Phần 6: Quy trình và thiết bị làm việc trong phòng thí nghiệm
• Phần 7: Giới thiệu sơ lược về phân loại nấm
• Phần 8: Các phương pháp lây bệnh nhân tạo
• Phần 9: Quản lý bệnh hại tổng hợp
• Phần 10: Các bệnh do nấm có nguồn gốc từ đất
• Phần 11: Các bệnh thường gặp trên một số cây trồng có ý nghĩa kinh tế
• Phần 12: Ảnh hưởng sức khỏe từ nấm gây bệnh
• Phần 13: Thiết kế, xây dựng và vận hành các phòng thí nghiệm và nhà lưới dùng cho chẩn đoán
• Phần 14: Phụ lục về cách làm que cấy dẹp, sức khỏe an toàn trong công việc, cũng như các công thức nấu môi trường, các phương pháp khử trùng, và các phương pháp lưu giữ mẫu nấm.